FOLLOW US ON
+7 (495) 374-04-01
Отраслевые решения
Задать вопрос

STED+АСМ

Атомно-силовая микроскопия и суперразрешающая оптическая микроскопия STED в одной системе!

Исследования в области наук о живом требуют все более высокого разрешения для анализа биологических образцов. Отсюда вытекает задача разработки новых оптических и неоптических визуализирующих методик. Неинвазивный метод атомно-силовой микроскопии позволяет получать топографию образца с высоким разрешением без надобности различных меток. Топографические, электрические, магнитные и механические  данные  АСМ совместно с коррелированными   данными флюоресценции представляют мощный инструмент для глубокого и более полного анализа свойств образца. Если же АСМ совместить с суперразрешающей оптической методикой (как, например, STED), то можно получить универсальный наноскопический инструмент для исследования морфологии за дифракционным пределом. В статье  описан метод совмещения АСМ и STED и результаты, полученные группой профессора Альберто Диаспро в Генуе.

Метод  STED

Принципиальная схема комплексной системы STED+АСМ, отражающая основные элементы: разделенные во времени импульсы от источника возбуждения и луча STED, детектор и АСМ. Схематично показаны интенсивности луча возбуждающего лазера (A), лазера с пятном формы бублика (B), а также их наложения (C). 

Флюоресцентная микроскопия  играет ключевую роль в науках о живом, однако же дифракционный предел ограничивает возможности визуализации структур с размерами меньше половины длины волны возбуждения. Этот лимит можно обойти с использованием суперразрешающих методик, таких как STED, PALM (photoactivated localization microscopy) или STORM (stochastic optical reconstruction microscopy). Метод STED обладает рядом преимуществ перед остальными методиками — он обеспечивает быстрый сбор данных, что позволяет изучать динамические процессы (например, движение везикул in vivo, активность дендритных отростков или актинового цитоскелета.

Размер сфокусированного пятна от одиночного лазера ограничен длиной волны излучения. Принцип метода STED основан на комбинации двух различных импульсных лазеров, фокусируемых в одну точку. Первый лазер возбуждает флюоресцентную молекулу, а второй имеет фазовую модуляцию для контроля распределения интенсивности и временную задержку, не превосходящую время спонтанного испускания флюорофора. Второй лазер обедняет возбужденный уровень молекул и переводит их в основное состояние, подавляя спонтанное излучение в части пятна первого лазера. В результате собирается сигнал спонтанного излучения от оставшейся части молекул.

Для визуализации за дифракционным пределом лазер STED имеет пятно в виде бублика. Так оказывается возможным достичь разрешения в десятые доли нанометра и получить 3D-разрешение в 40-45 нм внутри клетки.

Метод  АСМ

Комплексная установка STED+АСМ в лаборатории профессора Alberto Diaspro в Генуе.

На сегодняшний день АСМ успешно себя зарекомендовала как метод определения наноструктуры поверхности образцов с субнанометровым пространственным разрешением. Особенно полезной и важной методика АСМ является при исследовании образцов в жидкой среде. С помощью этого метода успешно были изучены многие биологические объекты: белки, ДНК, мембраны, везикулы и целые живые клетки.

Помимо высокоразрещающей топографии, с помощью АСМ-технологии NanoWizard можно получать информацию о структурных и, например, механических свойствах образца. Зонд  АСМ можно использовать для индентирования поверхности образца с целью получить данные о его локальной жесткости. Благодаря последней разработке JPK — режиму количественный изображений QITM измерения механических свойств можно проводить с той же скоростью и тем же разрешением, что и в стандартной визуализации АСМ.

В общем и целом, методика АСМ не нуждается в каком-либо мечении образца, поэтому можно сказать, что она работает не селективно, что может оказаться негативным для некоторых биологических исследований. Оптическая флюоресцентная микроскопия дает эту селективность, или специфичность, и поэтому зачастую используется совместно с АСМ.

Система АСМ+STED

Для демонстрации успешного сочетания двух методик использовались образцы, легкие в подготовке и стабильные при возмущении окружающей среды –флюоресцентные шарики. На рисунке 3 можно явно видеть преимущество сочетания АСМ+STED над данными конфокальной микроскопии. Изображения STED имеют гораздо лучшее разрешение, чем конфокальные. Каждый 40-нанометровый шарик отлично разрешается в изображении STED и АСМ, тогда как в данных конфокальной микроскопии отдельные шарики внутри кучки не различить. На увеличенных изображениях кучек наглядно показано, почему STED+АСМ лучше, чем конфокал.

    
Рисунок 3. Данные конфокальной микроскопии (a), АСМ (b), STED (c), полученные с 40 нм флюоресцентными шариками. На оптическом изображении выделены области сканирования АСМ. Наложение АСМ-изображения с конфокальным (d) и STED (e). Топография АСМ коррелирует с данными конфокальной микроскопии (f) и STED (g). Рисунок 4. Конфокальное изображение (a) и STED (b) меченных Atto647 N микротрубочек в клетках COS7. Полученная из карт АСМ топография (c) и рассчитанная карта упругости (f) коррелирует с данными STED (e) и конфокальной микроскопии (d).

 

       

Совсем недавно успешно были продемонстрированы красивейшие результаты исследования биологических клеток в водной среде. На рисунке 4 представлены изображения конфокальной микроскопии и STED одной и той же области клеток COS7, меченных антителами.

Пример возможных приложений

Для одновременной записи топографии и карт эластичности образца команда JPK разработала режим количественных изображений QITM. Преимуществом этого режима является уменьшенное влияние зонда на образец, что защищает его от разрушения. В каждой точке записывается силовая кривая, из которой можно получить  данные  топографии. На рисунке 4c можно наблюдать убедительную картинку 3D-реконструкции по данным силовых кривых. Соответствующие изображения конфокальной микроскопии 4d и STED 4e раскрывают сеть микротрубочек с участием пучков и отдельных филаментов. Можно наблюдать недостаточность разрешения конфокальной микроскопии.

Каждая силовая кривая далее может быть использована для расчета модуля Юнга, который дает информацию об эластичности образца.

Заключение

Сочетание революционной АСМ-технологии JPK NanoWizard и суперразрешающей оптической системы STED может быть использовано в исследовании различных образцов. Особенно полезно это для приложений, где специфичность и мечение может сделать АСМ универсальным методом. Объединяя методики, Вы исключаете различные возможные артефакты и избирательно оставляете в фокусе научных исследований интересующие структуры.

 

 

Закрыть

Задать вопрос

Оборудование для контроля воды IMC Systems - научное оборудование, инспекция в полупроводниковой промышленности, оборудование для экологического мониторинга и контроля технологических процессов

ФИО*
Компания
E-mail*
Телефон*
Вопрос*