FOLLOW US ON
+7 (495) 374-04-01
Отраслевые решения

Оптический пинцет в исследовании вируса гриппа

Вирус гриппа является патогеном с высокой проникающей способностью, вызывающим ежегодные эпидемии среди людей. Жизненный цикл его многостадиен, досконально не изучен ни один из этапов. На сегодняшний день все препараты, нацеленные на блокировку вирусной инфекции, не являются универсальными из-за быстро меняющейся антигенной активности вируса, определяемой двумя поверхностными белками — гемагглютинином (ГА, инициирует начальное соединение с мембраной – мишенью и слияние вирусной оболочки с эндосомальной мембраной) и нейраминидазой (НА).

Первый шаг в инфецировании заключается в соединении вируса с клеткой хозяина. Поэтому важно знать силы, вовлекаемые в данный процесс. Молекулярная динамика представляет из себя копьютерное моделирование различных процессов, и на его основе можно теоретически рассчитать взаимодействие между всеми атомами в данной системе. А если еще вооружиться такими мощными инструментами для экспериментального измерения сил в биологических системах, как оптический пинцет и силовая спектроскопия отдельных молекул АСМ, то можно заглянуть в жизнь коварного вируса и распознать ее уязвимые этапы.

Ученым из Университета Гумбольта удалось получить силу взаимодействия между вирусом и живыми клетками с помощью трех независимых методов — молекулярной динамики, атомно-силовой спектроскопии и оптического пинцета. Исследования методом атомно-силовой спектроскопии показали силы взаимодействия между ГА и его рецепторами в районе 10-25 пН. Кроме этого наблюдались последовательные ступеньчатые события разрыва, которые строго указали на многовалентность связывания вируса с клеточной поверхностью.

Использование молекулярной динамики обнаружило, что домен связывания с рецептором у ГА является очень жестким и не деформируется при отсоединении от лиганда, что указывает на отсутствие кооперативности между мономерами ГА в процессе связывания. Пути отсоединения оказались различными.

Вот как ученые описывают свои эксперименты:

Схема экспериментов с  вирусом гриппа(A) Вирионы, меченные R18, были адсорбированы полистери-новыми бусинами, что подтвержда-лось конфокальной микроскопией. Масштаб 0.5 мкм. С использованием оптического пинцета была измерена сила взаимодействия между вирусом на бусине и клетками, культурированными в чашках Петри. (B). Для экспериментов АСМ вирионы были ковалентно пришиты к зонду АСМ с помощью бифункциональной молекулы – привязи(C). Функциональный кантилевер подводился к клеткам до прикрепления вируса, и сила отрыва была записана при отводе

Для экспериментов с применением оптического пинцета JPK Nanotracker белки вируса быстро и крепко адсорбировались на полистериновой поверхности. Мы покрыли поверхность 1,5 мкм полистериновых бусин вирусом гриппа А X-31. Клетки плотностью 1-5×105 штук на чашку Петри культурировались, затем добавили бусин, покрытых вирусом, поймали их ловушкой и двигали на 3-5 мкм от клеточной границы. Расстояния и скорость устанавливались с помощью программного обеспечения, и каждый цикл растяжения – возврата записывался 1-5 раз. Затем меняли бусину и позицию на клетке. Мы выбирали ясные и резкие границы на клетке чтобы исключить возможное артефактное прикрепление бусины к филоподии и другим выступам клетки. Контактная сила поддерживалась между 5 и 50 пН. Для клеток яичника китайского хомячка сила отрыва составила около 12 пН при скорости растяжения 200 нм/c. Для клеток почек собаки сила разрыва составила 10 пН при той же скорости. Но для второго типа клеток в отличие от первого, при больших значениях сил мы обнаружили множественные события разрыва с максимумом в 23 пН, что соответствует соединению вируса со многими рецепторами. Это наблюдение может означать содержание сиаловой кислоты клетками MDCK на 30% больше. Для того, чтобы удостовериться, что вирус прикрепляется именно к сиаловой кислоте, мы оценили соединение вируса через замещение терминальных остатков сиаловой кислоты нейраминидазой (НА). В этом случае сила разрыва оказалась примерно такой же, как без обработки НА, но вероятность соединения оказалась на 60-70 % меньше. Это указывает на специфическое взаимодействие ГА с сиаловой кислотой.

АСМ:

Вирус гриппа был ковалентно присоединен к кантилеверу АСМ. Использовались 3 типа клеток (CHO, MDCK  и А549). Их содержание сиаловой кислоты было описано лектин-связывающим раствором). Кантилевер перемещался над клетками до момента прикрепления к плазматической мембране. Для динамического анализа силовой спектроскопии взаимодействий силовые кривые записывались при различных скоростях отвода кантилеввера. Для всех клеток сила разрыва лежала между 10 и 25 пН. Мы не обнаружили каких-либо отличительных особенностей для разных клеточных культур. Мы увидели как единичные, так и множественные последовательные события разрыва связей с рецепторами. Очень редко мы наблюдали разрывы при больших силах (>30 пН). 

Силовая спектроскопия клеток CHO (яичника китайского хомячка) с использованием оптического пинцета(слева). Бусины с пришитым вирусом двигались к клеткам до прикрепления, а затем отводились. Были записаны единичные разрывы различной высоты (A). При обработке поверхности молекулами блокирующими молекулами, взаимодействия не наблюдалось (Aвставка).

Силовая спектроскопия АСМ клеток CHO (яичника китайского хомячка) и MDCK (почек собаки) (справа). Взаимодействие вируса с единичным рецептором (A) и множественными рецепторами (B), которое ведет к множественным разрывам (B). При блокировании кантилевера BSA взаимодействий не наблюдалось(Aвставка). 

Гемагглютинин связывается с остатками сиаловой кислоты гликопротеинов и гликолипидов с константой диссоциации в милимолярном диапазоне, что указывает на многовалентную связь. В данной работе описано прикрепление вируса гриппа к клеткам хозяина с использованием трех независимых подходов. Оптический пинцет и силовая спектроскопия отдельных молекул АСМ показали очень маленькие силы взаимодействия. В дальнейшем наблюдение последовательных событий разрыва строго означало многовалентное соединение вируса с клеточной мембраной хозяина. Молекулярная динамика продемонстрировала множественность путей отсоединения, что указывает на высокодинамичное взаимодействие между ГА и его рецепторами.

Читать полный текст статьи: Influenza virus binds its host cell using multiple dynamic interactions