FOLLOW US ON
+7 (495) 374-04-01
Отраслевые решения

Эллипсометрия в исследовании кинетики связывания

В области протеомики ученые сталкиваются с классом молекул с непредсказуемыми свойствами. Для их описания предпочтение отдается методам исследования белков без необходимости химической модификации. Наиболее популярным здесь является поверхностный плазмонный резонанс, для которого необходим тонкий слой золота или серебра на твердой подложке, а реализация требований должна соблюдать высочайшие стандарты. Все текущие приложения в большинстве своем ограничены в области интереса: массивы белков на стандартный стеклянных слайдах не могут быть считаны или даже охарактеризованы кинетически.

Важной задачей является количественное описание афинности антител и анализ их неспецифического связывания. Очень полезным инструментом здесь является визуализирующая эллипсометрия Accurion. Метод позволяет исследовать взаимодействие антител со всем  массивом иммобилизованных на подложке антигенов в режиме реального времени и без необходимости химической модификации. С помощью приборов Accurion сегодня можно одновременно анализировать данные со 150 каналов, полученные благодаря запатентованной концепции Regions Of Interst (ROI). Отличие от обычного поверхностного плазмонного резонанса заключается в том, что связывание лиганда с несколькими рецепторами можно изучать в одном эксперименте, и получать таким образом полную картину данных биочипа. С использованием специальных слайдов OptiSlides можно добиться высокой чувствительности.

В приведенной статье описана методика определения константы связывания поликлональных антител иммуноглобулина кролика IgG с антигеном и изучена специфичность поликлональных антител.

Пошаговое детальное описание экспериментов выглядит следующим образом:

1. Помещение слайдов в специальную поточную ячейку для исследования кинетики.

2. Заполнение ячейки необходимым буфером с помощью шприцевого насоса с определенной периодичностью

3. Визуализация при определенном угле падения и подстройка оптических компонент для улучшения контраста

4. Выравнивание латерального положения интересующих областей (пятен биочипа)

5. Определение каналов считывания данных по соответствующим областям интереса

6. Измерение эллипсометрического угла дельта для областей интереса и окружения для рассчета толщины и массы.

7. Для экспериментов с кинетикой антитела определенной концентрации (3 — 700 нМ) периодично вводили с помощью шприцевого насоса в специальную ячейку с антигенами (иммобилизованными на подложке). Связывание отслеживалось путем записи значений угла дельта с шагом в 10 секунд. Для каждой концентрации использовался новый массив.

По результатам экспериментов были построены графики кривых связывания и по характерным временам вычислены константы связывания.

Кинетику связывания можно единовременно отследить для каждого пятна биочипа.

Оптическое моделирование позволяет рассчитать коэффициент преломления материалов. В данной работе рассчитана толщина индивидуальных пятен для 3D-визуализации поверхности исследуемого чипа. Рисунок 2 отображает массив белка IgG кролика до и после связывания с комплементарным антителом.

Рис.1 Изменение эллипсометрического угла дельта с течением времени для различных концентраций антител Рис.2 Эллипсометрические карты толщины массива IgG до (слева) и после (справа) связывания с соответствующим антителом

 

Специфичность поликлональных антител

Во второй серии экспериментов исследовалась специфичность связывания поликлональных антител кролика. Для этого был приготовлен биочип с пятью белками, четырьмя антителами и сывороткой альбумина в двух концентрациях. Визуализирующий эллипсометр EP3, оснащенный 2x объективом, способен визуализировать область 2×3 мм, что соответствует массиву пятен 4×5 — рисунок 3.  Рядом справа можно наблюдать специфичность связывания: его отсутствие для антигенов миогловина козы, антигенов инсулина мыши и бычьего сывороточного альбумина.

Рис.3 Рис.4  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Читать оригинал статьи: Kinetic Binding Studies using OptiSlides