FOLLOW US ON
+7 (495) 374-04-01
Отраслевые решения

Оптический пинцет

Исследования в области нанотоксикологии и перспективы использования наночастиц в качестве мембраны для адресной доставки медикаментов являются крайне актуальной задачей.

Компания JPK Instrumnets (Германия) — признанный в мире производитель научно-исследовательского оборудования для атомно-силовой микроскопии биологических объектов представляет новинку — оптический пинцет (захват) — прибор, открывающий перспективу исследований и количественного измерения особенностей взаимодействия вируса с клеткой-хозяином.


Интерес к вирусу гриппа всегда находится на высоком уровне ввиду широкого его распростанения и большому влиянию на жизнь человечества. Вирус принадлежит широкому классу оболочечных вирусов и является патогеном с высокой проникающей способностью, вызывающей ежегодные эпидемии и приводящий к тяжелым последствиям для организма вплоть до летального исхода.

Оболочка вируса содержит два выступающих белка, гемагглютинин и нейраминидазу, а также протонный канал M2. Гемагглютинин  — гомотример, инициирует начальное соединение с мембраной – мишенью и слияние вирусной оболочки с эндосомальной мембраной клетки-хозяина. Гемагглютинин связывается с остатками сиаловой кислоты гликопротеинов и гликолипидов мембраны с константой диссоциации в милимолярном диапазоне, что указывает на многовалентную связь.

Совместно с группой ученых из Германии, JPK Instruments провели исследования механизмов прикрепление вируса гриппа к клеткам хозяина с использованием различных независимых методик. Оптический пинцет и силовая спектроскопия отдельных молекул АСМ показали очень маленькие силы взаимодействия. В дальнейшем наблюдение последовательных событий разрыва строго показало многовалентное соединение вируса с клеточной мембраной хозяина.


Индентификация присоединения вируса к клетке хозяина с помощью оптического пинцета

Первый шаг в инфецировании заключался в соединении вируса с клеткой хозяина. Оптический пинцет и силовая спектроскопия отдельных молекул АСМ являются мощными методами для измерения сил в биологических системах.

Ученые применили силовую спектроскопию отдельных молекул для описания сил взаимодействия между вирусом гриппа А и живыми клетками. Исследования показали силы взаимодействия между ГА и его рецепторами в районе 10-25 пН. При этом, наблюдение последовательных ступеньчатых событий разрыва строго указало на многовалентное связывание вируса с клеточной поверхностью.

Индентификация присоединения вируса к клетке хозяина

(1 — связь между бусиной и клеткой; 2 — силовая кривая взаимодействия бусина-клетка)

Описание эксперимента

В эксперментальных исследованиях для закрепления белков использовались бусины диаметром 1,5 мкм. Далее, в раствор культивированных клеток добавлялись бусины, покрытые вирусом. С помощью оптического захвата устанавливался контроль над положением бусины и ее последующее контроллируемое перемещение в диапазоне 3-5 мкм от клеточной границы. Расстояния и скорость устанавливались, а каждый цикл растяжения-сжатия записывался многократно для набора статистики. Высокая воспроизводимость данных подтверждалась на различных бусинах, при этом на клетке выбирались четкие границы, чтобы избежать прикрепление бусины к филоподии и другим выступам клетки.

Для клеток яичника китайского хомячка сила отрыва составила около 12 пН для скорости растяжения 200 нм/c. Для клеток почек собаки наиболее частой сила разрыва составляла 10 пН при той же скорости. Но для вторых клеток в отличие от первых, при больших значениях сил были обнаружили множественные события разрыва с максимумом в 23 пН, что соответствует соединению вируса со многими рецепторами. Это наблюдение может означать содержание сиаловой кислоты клетками MDCK на 30% большего, чем другими клетками. Для того, чтобы удостовериться, что вирус прикрепляется именно к сиаловой кислоте, оценили соединение вируса через замещение терминальных остатков сиаловой кислоты нейраминидазой. В этом случае сила разрыва оказалась примерно такое же, как без обработки НА, но вероятность соединения оказалась на 60-70 % меньше. Это указывает на специфическое взаимодействие ГА с сиаловой кислотой.

Схема проведения эксперимента

Вирионы, меченные R18, были адсорбированы полистериновыми бусинами, что подтверждалось результатами исследований в конфокальном микроскопе (литера А). Оптический пинцет использовался для определения сил взаимодействия между вирусом на бусине и клетками, культурированными в чашках Петри. (литера B). Для экспериментов АСМ вирионы были ковалентно пришиты к зонду АСМ с помощью бифункциональной молекулы – привязи (литера C). Функциональный кантилевер подводился к клеткам до прикрепления вируса, и сила отрыва регистрировалась при отрыве.

Силовая кривая клеток CHO (яичника китайского хомячка) с использованием оптического пинцета. Бусины с пришитым вирусом двигались к клеткам до прикрепления, а затем отводились. Были записаны единичные разрывы различной высоты (A). При обработке поверхности молекулами блокирующими молекулами, взаимодействия не наблюдалось (A, вставка).


Подтверждение с помощью атомно-силового микроскопа

Для подтверждения результатов, полученных с помощью оптического пинцета использовался атомно-силовой микроскоп JPK NanoWizard 3. Вирус гриппа был ковалентно присоединен к кантилеверу АСМ. Использовались 3 типа клеток (CHO, MDCK  и А549). Cодержание ими сиаловой кислоты было описано лектин-связывающим раствором. Кантилевер перемещался над клетками до момента прикрепления к плазматической мембране.

Силовые кривые клеток CHO (яичника китайского хомячка) и MDCK (почек собаки) (справа). Взаимодействие вируса с единичным рецептором (A) и множественными рецепторами (B), которое ведет к множественным разрывам (B). При блокировании кантилевера BSA взаимодействий не наблюдалось(A, вставка).

Для динамического анализа силовой спектроскопии взаимодействий силовые кривые записывались при различных скоростях отвода кантилеввера. Для всех клеток сила разрыва лежала между 10 и 25 пН, что находится в удовлетворительном соответствии с результатами, полученными на оптическом пинцете.